AAV病毒使用操作手册
一、AAV病毒的储存与稀释:
1. 病毒的储存:收到病毒液后在很短时间内即使用AAV病毒进行实验,可以将病毒暂时放置于4 ℃保存;如需长期保存请放置于负80℃冰箱保存(病毒置于冻存管,并使用封口膜封口)
① 病毒可以存放于负80℃冰箱6个月以上;但如果病毒储存时间超过6个月,建议在使用前重新测定病毒滴度。
② 反复冻融会降低病毒滴度:每次冻融会降低病毒滴度10%左右;因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融,为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装然后冻存。
2. 病毒的稀释:如果需要稀释病毒,请将病毒取出置于冰浴融化后,使用培养目的细胞用无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)或PBS稀释。混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 或负80度冰箱冻存。
二、AAV病毒用于体外(In Vitro)实验:
感染培养原代细胞和建系细胞。AAV病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同,在使用AAV病毒之前可以通过查阅相关文献,了解AAV病毒对您的目的细胞的亲嗜性,感染复数(MOI 值)以及在体内(In Vivo)注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支持,可以通过感染预实验得到合适的感染复数(MOI 值)(使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性)。
AAV病毒感染目的细胞预实验:
1. AAV病毒感染目的细胞预实验注意事项:
① 测定AAV病毒对目的细胞的亲嗜性时,需要同时设置对AAV病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293,Hela)作为平行实验的对照细胞。
② 在进行AAV病毒感染实验时,可以用完全培养基(培养目的细胞用)稀释;理论上,含有血清,双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响AAV病毒的感染效率。
③ 一般AAV病毒单位为vg/ml,即每毫升病毒液中含有的病毒基因组拷贝数。如:病毒滴度为1×1012 vg/ml 即每毫升病毒液中含有1×1012病毒基因组拷贝数。
2. 以24孔培养板为例,进行目的细胞和HEK293细胞的感染预实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔,并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量,一般情况下MOI值从105~106之间,如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。
⑴ 第一天,准备细胞:在24孔培养板接种若干孔,每个孔内接种3~5×104个目的细胞,铺板时细胞的融合率为50%左右,每孔培养基体积为100 μl;进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右。
⑵ 第二天,准备病毒:取出4℃保存的病毒,用移液器混匀;如果是冻存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根据实验室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到培养基中,并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积,以期获得******的感染效率。
⑶ 第二天,感染目的细胞:病毒准备好之后,从培养箱中拿出细胞,首先观察细胞生长状态,如细胞状态较好则可以开始实验。
① 使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基。
② 吸去培养器皿中的培养基(如果细胞生长良好,密度适宜,则不用换液)。
③ 在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液。
④ 混匀后置于二氧化碳培养箱(37℃、5% CO2)孵育过夜。
注意:感染前细胞的状态好坏对最终的感染效果高低影响很大,所以务必保证加病毒之前细胞处于良好的生长状态。亦可以将预先准备好的培养基和AAV病毒的混合液直接加入培养器皿中。AAV病毒对目的细胞的感染效率较低,通过提高MOI 值可以提高病毒的感染效率。
⑷ 第三天,更换培养液:一般在24小时后将含有AAV病毒的培养液更换成正常培养液,也可以不用换液,在感染后每天观察细胞生长状态。
⑸ 第六天,感染效率检测:在倒置荧光显微镜观察荧光,估计AAV病毒感染目的细胞的效率;如果由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带Marker Gene的,可以通过Real-time PCR检测病毒的基因组拷贝数。
注意:
1. 有些AAV病毒载体上带有GFP 绿色荧光蛋白,使用者可以在病毒感染96小时后使用倒置荧光显微镜观察GFP 绿色荧光,以观察AAV病毒对目的细胞的感染情况。如果AAV病毒载体携带其他Marker Gene如RFP\BFP可以用荧光显微镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况。
2. AAV病毒表达时间较慢,荧光表达所需时间较长,建议感染后96小时后观测荧光表达。感染后的细胞可以连续培养两周,通过观察荧光的表达时间和表达强度来确定AAV病毒对目的细胞的感染情况。感染期间请根据细胞生长的情况对细胞进行及时换液,以保证细胞良好的生长状态。
三、AAV病毒安全使用规范:
1.病毒操作时最好使用生物安全柜。如果使用普通超净工作台操作病毒,请不要打开排风机。
2.病毒操作时请穿实验服,带口罩和手套。
3.操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用 70%乙醇加1% SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头,离心管,培养板,培养液请于84 消毒液或1% SDS 中浸泡过夜后弃去。
4.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤:拧紧培养瓶或盖紧培养板。用70%乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前,用70%乙醇清理显微镜实验台。
5.如需要离心,应使用密封性好的离心管,或者用封口膜封口后离心,而且尽量使用组织培养室内的离心机。
6.脱掉手套后,用肥皂和水清洗双手。
四、悬浮细胞感染方法概要:
1. 根据细胞的量将细胞在15ml 管中离心收集,然后用1~2ml 的无血清培养液稀释细胞沉淀, 以细胞完全浸没在培养基中为准。
2. 按照MOI 换算病毒颗粒数量,吸取病毒液加入细胞中,将15ml 离心管置入水平离心机 1000rpm低速离心1小时,然后再放入37℃,CO2培养箱中孵育2~3小时。
3. 将离心管中混合液体吸出加到培养皿或培养瓶中。
4. 加入足够量的新鲜培养液。
5. 96 小时后观察细胞阳性率。
五、 相关专业术语:
MOI:病毒感染复数传统的MOI 概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值,也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为MOI 是一个比值,没有单位,其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来MOI 被普遍用于病毒感染细胞的研究中,含义是感染时病毒与细胞数量的比值,本手册中提到的MOI都是沿用这个概念。然而,由于病毒的数量单位有不同的表示方式,从而使MOI 产生了不同的含义。能产生细胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量,因此其MOI 的含义与传统的概念相同。
六、 细胞培养器皿的相关参数:
Flask/Dish |
Surface (mm2) |
Cell number |
Media Volume |
96 well plate |
50 |
1.5-5.0×104 |
100 μl |
48 well plate |
100 |
3.0×104-1.0×105 |
200 μl |
24 well plate |
200 |
8.0×104-2.0×105 |
500 μl |
12 well plate |
401 |
1.6-4.0×105 |
1.0 ml |
6 well plate |
962 |
3.0-8.0×105 |
2.0 ml |
35mm |
962 |
3.0-8.0×105 |
2.0 ml |
60mm |
2827 |
1.0-2.5×106 |
6.0 ml |
100mm |
7854 |
2.5-6.4×106 |
10.0 ml |